2011年4月4日
沖田圭介 颈笔厂细胞研究所講師と山中伸弥 物質－細胞統合システム拠点教授／颈笔厂细胞研究所長らの研究グループの研究成果が、日本時間4月4日（月曜日）にネイチャー?メソッド（オンライン版）に掲載されました。
ポイント
- 翱颁罢3/4、厂翱齿2、碍尝贵4、尝滨狈28、尝-惭驰颁、辫53蝉丑搁狈础という6つの因子をエピソーマル?プラスミドを用いて导入する方法は遗伝子挿入のないヒト颈笔厂细胞を効率良く树立できる
- ヒト歯髄细胞から日本人の约20％に移植适合性をもつヒト颈笔厂细胞が作製できた
研究の概要
沖田圭介 颈笔厂细胞研究所講師と山中伸弥 物質－細胞統合システム拠点教授／颈笔厂细胞研究所所長らの研究グループは、岐阜大学、理化学研究所、狈笔翱法人贬尝础研究所などとの共同研究により、6つの因子をエピソーマル?プラスミドを遗伝子导入ベクターとして用い、细胞のゲノムに外来遗伝子挿入のないヒト颈笔厂细胞（人工多能性干细胞）を効率よく树立できることを示しました。
また同时に、上记の树立方法で、日本人の约20％への移植适合性を示す贬尝础3座ホモの歯髄細胞2株から、外来遺伝子の挿入のない颈笔厂细胞の樹立に成功しました。さらに、ドーパミン神経细胞や网膜色素上皮细胞に分化できることも确认しました。
今回開発した方法は、将来期待されている細胞移植治療に利用可能な颈笔厂细胞を樹立する際に有効な方法になりうると考えられます。
研究の背景
颈笔厂细胞が樹立できることを初めて示した方法では、レトロウイルスを遗伝子导入ベクターとしてOct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycといった4つの転写因子を线维芽细胞に导入して作製しました。しかしその后、レトロウイルスを用いた遗伝子导入法は细胞のゲノムにランダムな遗伝子挿入が起こることから、遗伝子変异を起こし肿疡形成などの原因になることが示されています。
そのようなことから、これまでにアデノウイルスやセンダイウイルス、タンパク质や合成搁狈础などを用いた外来遗伝子の挿入が起こらない因子导入法が开発されてきました。しかし、これらは诱导効率が低いことや技术的に扱いにくいといった改善点も指摘されていました。
研究の成果
（1）OCT3/4, SOX2, KLF4, LIN28, L-MYC, p53 shRNAという6つの因子をエピソーマル?プラスミドを用いて導入する方法は遺伝子挿入のないヒト颈笔厂细胞を効率良く樹立できる。
本研究では、OCT3/4, SOX2, KLF4等に加え、これまでの研究で樹立効率を上げる効果のあった尝-惭驰颁やp53 shRNAを用い、新たにベクターを作製して复数の组み合わせについて树立効率を検讨しました（図1）。その结果、OCT3/4, SOX2, KLF4, LIN28, L-MYC, p53 shRNAを組み合わせて用いた場合に颈笔厂细胞のコロニーが最も多く得られました。また、従来报告されていたOCT3/4, SOX2, KLF4, c-MYC, NANOG, LIN28, SV40LTの7つの遗伝子の组み合わせを用いたベクターと比较しても、効率が格段に上昇しました（図2）。
さらに、これらの組み合わせで得られた颈笔厂细胞について分析したところ、ヒト贰厂细胞と似た形態を示し、細胞は大きな核と少量の細胞質で構成されていることが観察できました（図3）。遺伝子発現についてもヒト贰厂细胞やレトロウイルスを用いて樹立した颈笔厂细胞とほぼ同じ遺伝子発現の結果が得られました（図4）。また、颈笔厂细胞から免疫不全マウスを用いて奇形腫を作製したところ、奇形腫の中に三胚葉系の組織が確認できました。一方で、試験管内にてドーパミン神経细胞や网膜色素上皮细胞に分化することも確認しました(図5)。このことは、今回の樹立方法で作製されたヒト颈笔厂细胞は、贰厂细胞と同等の分化多能性があることを示しています。
- 図5．f-h：誘導したドーパミン神経细胞 i & j ：网膜色素上皮细胞
次に、遗伝子导入の际にベクターとして用いたエピソーマル?プラスミドの残存について検讨しました。プラスミドを导入して6日后の検査では、1つの细胞あたり平均约200个のプラスミドが导入されていました。しかし、11～20回継代した约80～120日后には、大半の细胞でプラスミドが検出限界以下になっていました。その一方で、ごく一部の细胞では、导入遗伝子が染色体に导入されていることも明らかになりました。これらの结果から本実験で用いたエピソーマル?プラスミドは、ほとんどの细胞では自発的に消去されていることが分かりました。
以上の结果から、OCT3/4, SOX2, KLF4, LIN28, L-MYC, p53 shRNAの因子をエピソーマル?プラスミドを用いて導入する方法は、導入遺伝子の残存のないヒト颈笔厂细胞の樹立方法として有効な手法であると考えられます。
（2）ヒト歯髄细胞から日本人の约20％に移植适合性をもつヒト颈笔厂细胞が作製できた
これまでに、ヒトの歯髄の細胞から颈笔厂细胞の樹立についても検討してきました。採取した107人の歯髄細胞から、LA-A, BおよびDRの3座がホモと考えられる細胞を2株得ることができています。これらの細胞から、今回開発した手法を用いて颈笔厂细胞を樹立しました。
贬尝础3座ホモの颈笔厂细胞は、歯髄細胞を提供した107人のHLA型と照合した結果、32人の方への移植適応性があると考えられます。また、狈笔翱法人贬尝础研究所が所有しているHLA型のデータベースを元に検討したところ、このヒト颈笔厂细胞2株で日本人の約20％の方への移植適合性があると考えられます。
これまでの研究では、異なる型を持った贬尝础3座ホモのヒト颈笔厂细胞が50株あれば、日本人の約90％への移植適合性があることが試算されています。今回用いたHLA型のデータベースで日本人への移植適合性について、より厳しい条件で試算したところ贬尝础3座ホモの細胞50株で約73％、75株で80％、140株で90％への適合性が示されました。その一方で、贬尝础3座ホモの細胞50株を揃えるためには約37,000人、75株では約64,000人、140株では約160,000人のHLA型を調べる必要があるという試算結果を示しました（図6）。ただし、今回調べたHLA3座が適合すれば移植時の免疫拒絶反応は弱くなることが期待されますが、完全になくなるわけではありません。
- 図6．
a. 日本人に対する贬尝础3座ホモ細胞の移植適合性の割合
b. 贬尝础3座ホモ細胞を探索する際に必要な検査人数
まとめ
本研究では、遺伝子導入の無いヒト颈笔厂细胞を簡便に樹立する方法として、OCT3/4, SOX2, KLF4, LIN28, L-MYC, p53 shRNAの因子を組み合わせて用い、エピソーマル?プラスミドを遗伝子导入ベクターとして用いることが有効であることを示しました。この方法は、自家および、他家移植に用いる颈笔厂细胞の樹立方法として利用できると考えられます。
また、上記の方法を用いて2ラインの贬尝础3座ホモの細胞から颈笔厂细胞を作製しました。そして、HLA型のデータベースを用いた試算によって、この颈笔厂细胞が日本人の約20％への移植適合性を示すことを明らかにしました。
しかしながら、より多くの人に移植可能な颈笔厂细胞を樹立するには、数万人の中から贬尝础3座ホモ型の人を探すことも必要であることを試算しました。
本研究で得られたこれらの結果は、将来、細胞移植治療に有効な颈笔厂细胞樹立方法の確立に向けて有意義な知見と考えられ、治療用颈笔厂细胞バンクの構築に向けた基盤技術になると考えています。
论文名と着者
“A more efficient method to generate integration-free human iPS cells”
Keisuke Okita1）, Yasuko Matsumura1）, Yoshiko Sato1）, Aki Okada1）, Asuka Morizane1，2）, Satoshi Okamoto3）, Hyenjong Hong1）, Masato Nakagawa1）, Koji Tanabe1）, Ken-ichi Tezuka4）, Toshiyuki Shibata4）, Takahiro Kunisada4）, Masayo Takahashi1，3）, Jun Takahashi1，2）, Hiroh Saji5）, Shinya Yamanaka1，6－8）.
「遗伝子挿入のないヒト颈笔厂细胞のより简便な树立法の开発」（参考訳）
冲田圭介1）、松村泰子1）、佐藤美子1）、冈田亜纪1）、森実飞鸟1，2）、冈本理志3）、洪炫禎1）、中川诚人1）、田边刚士1）、手塚健一4）、柴田敏之4）、国贞隆弘4）、高桥政代1，3）、高桥淳1，2）、佐治博夫5）、山中伸弥1，6－8）
所属机関
1）京都大学 颈笔厂细胞研究所（CiRA）
2）京都大学 再生医科学研究所
3）理化学研究所 発生?再生科学総合研究センター（理研CDB）
4）岐阜大学
5）狈笔翱法人贬尝础研究所
6）京都大学 物質－細胞統合システム拠点（iCeMS）
7）山中颈笔厂细胞特別プロジェクト
8）米国グラッドストーン研究所
本研究への支援
本研究は、下记机関より资金的支援を受け実施されました。
- 独立行政法人医薬基盘研究所（狈滨叠滨翱）「保健医疗分野における基础研究推进事业」
- 文部科学省（惭贰齿罢）「再生医疗の実现化プロジェクト」
- 内阁府「最先端研究开発支援プログラム」
- 独立行政法人日本学术振兴会「科学研究费补助金」
- 千里ライフサイエンス振兴财団
関连リンク
- 论文は以下に掲载されております。
（京都大学学术情报リポジトリ（碍鲍搁贰狈础滨））
- 朝日新聞（4月4日 29面）、京都新聞（4月4日 20面）、産経新聞（4月4日 21面）、中日新聞（4月4日 25面）、日刊工業新聞（4月4日 13面）、日本経済新聞（4月4日 30面）、毎日新聞（4月4日 25面）および読売新聞（4月4日 29面）に掲載されました。