2011年5月12日
森博幸 ウイルス研究所准教授と濡木理 東京大学大学院理学系研究科教授、塚崎智也 同助教、伊藤維昭 京都産業大学総合生命科学部教授らの研究グループは、細胞内でリボソームにより合成された蛋白質が生体膜を超えて輸送される際に、重要な役割を果たす膜蛋白質SecDFの詳細構造を世界で初めて解明しました。その構造から「生体膜を隔てた陽イオンの濃度差を利用してSecDFが大きな構造変化を繰り返し、膜を超えた蛋白質輸送に関与する」という新たな仮説を提唱し、いくつかの生化学と生物物理学の手法を駆使してこの仮説を立証しました。生命体に欠くことのできない基本的な生命現象の一つである蛋白質の輸送の仕組みを原子レベルで解析した本研究成果は、当該分野のみならず膜を超えた細胞内外へのイオンや薬剤等の輸送の研究にも大きな影響を与えることが期待されます。
本研究成果は、英国科学誌ネイチャー电子版に5月12日2时（日本时间）付けで公开されました。
（论文）
“Structure and function of a membrane component SecDF that enhances protein export”（蛋白質の膜透過を促進する膜蛋白質SecDFの構造と機能）
塚崎智也＊、森博幸＊、越前友香、石谷隆一郎、深井周也、田中剛史、Perederina Anna、Vassylyev Dmitry G.、河野俊之、Maturana Andre's D.、 伊藤維昭＊＊、濡木理＊＊（＊同等貢献、＊＊責任著者）
研究の背景
すべての细胞には新しく合成された蛋白质が、合成の场である细胞质からその蛋白质が実际に働く场所へと生体膜を超えて分泌输送される仕组みが备わっています。通常はイオンすら通さない生体膜が蛋白质という巨大な分子を透过させることができるのは、生体膜に蛋白质を膜透过させるための専用のチャネル（厂别肠トランスロコン）が存在しているからです。蛋白质の输送の仕组みについては、后にノーベル赏の受赏に结びついた、1975年にブローベルらが発表した「シグナル仮説」をはじめ、現在に至るまで数多くの研究結果が発表されています。原核生物におけるSecトランスロコンはSecYEGと呼ばれる膜蛋白質の複合体であり、Secトランスロコンを介した蛋白質の分泌は膜に局在するモーター蛋白質SecA によって駆動されています（図1A）。この時ATPがエネルギーとして使われますが、蛋白質の分泌がプロトン駆动力（笔惭贵）によっても促进されることは谜でした。
研究成果と意义
本研究では、真正细菌や古细菌で蛋白质の分泌に関わることが知られていた厂别肠顿贵という膜蛋白质に着目しました。厂别肠顿贵は厂别肠驰贰骋と复合体を形成し蛋白质の膜透过を高効率化していると考えられていましたが、実际にどのような働きをしているのかはほとんどわかっていませんでした。その原因として厂别肠顿贵が水に溶けにくい膜蛋白质であり取扱が困难であったことや、厂别肠顿贵の働きを细胞の形が失われた试験管内反応で解析することが困难であったこと等があげられます。今回の発表は、本研究グループの7年间にわたる厂别肠顿贵研究が実を结んだものです。まず厂别肠顿贵を安定かつ大量に精製する方法を确立し、结晶化に成功しました。続いて、大型放射光施设SPring-8を利用した齿线结晶构造解析によって厂别肠顿贵の构造を高分解能で决定しました。さらに、得られた立体构造から予测される厂别肠顿贵の机能部位を改変する一连の解析から厂别肠顿贵の働きを初めて明らかにしました。
SecDFの結晶構造から、SecDFは疑似2回対象に配置した12本のα-ヘリックスからなる膜貫通領域と2つの細胞外（ペリプラズム）領域（以下P1, P4と略します）から構成されることがわかりました（図1B）。P1領域は2つの構造単位、ヘッド領域とベース領域からなります。SecDFのP1領域はダイナミックな構造変化を起こし、ヘッド領域の配向が異なったF型とI型の2つの形をとります（図2）。また、SecDFの膜貫通領域はPMFを利用した薬剤排出トランスポーターAcrBの膜贯通领域と类似の构造をとることがわかり、厂别肠顿贵も水素イオンを利用することが考えられました。in vitroにおける蛋白質の膜透過反応を調べることによって、ATPとSecA が必要とされる膜透過を開始するステップと、その後ATPがなくても進行する蛋白質膜透過の後期?完了ステップに分けて解析することができます。この実験によりSecDFとPMFはこのATPに依存しない後期ステップに必要であることが突きとめられました。海洋性細菌由来のSecDFは、水素イオンの代わりにナトリウムイオンを利用して蛋白質膜透過を促進していることも明らかとされました。パッチクランプ法による电気生理学的解析と厂别肠顿贵の変异体解析によって、SecDFの膜貫通領域にはプロトンの通り道が存在することがわかり、この膜貫通領域の中心部に存在する進化的に保存されたアスパラギン酸残基、アルギニン残基（図3）が、プロトンの透過とSecDFの働きの両方に必須であることが証明されました。一方、膜から突出したP1領域は、膜透過途上にある分泌蛋白質など安定な構造をとっていない蛋白質と結合する性質があることがわかりました。P1領域の変异体解析から図2に示したP1領域の構造変化が実際に生体内で起こり、この構造変化が蛋白質の膜透過反応に重要であることを示しました。以上の結果から、図4に示したように「SecDFは水素（陽）イオンの細胞内への流入を利用して大きな構造変化を繰り返しながら、ペリプラズム側で膜透過基質蛋白質と相互作用し、膜透過の高効率化に寄与する膜内在性シャペロンである」との結論を得ました。
本研究では、蛋白质の膜透过に関わる厂别肠蛋白质群のなかで唯一构造の报告がされていなかった厂别肠顿贵の构造を明らかとし、その机能の详细を解明しました。今后、本研究成果によって図1に示した厂别肠トランスロコン复合体の立体构造と机能解析の研究が大きく进展することが期待されます。そして、膜を隔てた物质输送の研究分野一般にも大きな影响を与えることが期待されます。また近年多剤耐性遗伝子を持つ病原菌が问题となっていますが、これらの菌体は厂别肠顿贵を持つため、厂别肠顿贵の细胞外领域を标的とする新しいタイプの抗生物质が発见につながるなど、基础科学だけでなく医学への応用も期待されます。
本研究成果は、文部科学省科学研究費補助金[特定領域研究（22020008, 22020035）,新学術領域研究（22121503）],日本学術振興会科学研究費補助金[基盤（S）（20227003）, 基盤（A）（20247020）, 基盤（B）（22370070）, 若手研究B（21770135）], ターゲットタンパク研究プログラム, 科学技術振興機構バイオインフォマティクス推進センター （BIRD）などの支援を受けました。
- 図1 蛋白质の膜透过と厂别肠顿贵の详细构造。
A、 Sec蛋白質複合体による蛋白質の膜透過の模式図。
B、 SecDFの結晶構造。数字で示した12回の膜貫通領域（1-6と7-12が疑似2回対象）と細胞外（ペリプラズム側）に突出した領域から構成されています。
- 図2 厂别肠顿贵の贵型と滨型。笔1领域のヘッド领域の配向が异なった2つの形をとります。
- 図3 厂别肠顿贵の机能に重要なアミノ酸残基。膜贯通领域の中心部の膜贯通领域の拡大図を示しました。数字は膜贯通领域の番号を表しています。
- 図4 PMFを利用したSecDFの機能モデル。SecDFはSecYEGと複合体を形成します。SecA ATPaseによってSecYEGを介して運搬された前駆体蛋白質は細胞外でSecDFの細胞外領域と相互作用します（A）。その後SecDFはF型からI型へと前駆体蛋白質を保持したまま構造変化を起こし、蛋白質を透過させます（B）。最終的にプロトンの透過により、SecDFは蛋白質を手放し、I型からF型へと構造変化をします（C）。このような過程を繰り返すことによりSecDFは蛋白質の膜透過に関与するとのモデルを提唱しました。※ 必須のアルギニン残基（Arg）、 アスパラギン酸残基（Asp）を図中に模式的に示しています。
関连リンク
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- 以下は论文の书誌情报です。
Tomoya Tsukazaki, Hiroyuki Mori, Yuka Echizen, Ryuichiro Ishitani, Shuya Fukai, Takeshi Tanaka, Anna Perederina, Dmitry G. Vassylyev, Toshiyuki Kohno, Andres D. Maturana, Koreaki Ito & Osamu Nureki Structure and function of a membrane component SecDF that enhances protein export.
Nature Published online 11 May 2011