2012年6月13日
左から根岸教授、生沼助教、田坂博士后期课程学生
生沼泉 生命科学研究科助教と田坂元一 同博士後期課程学生、根岸学 同教授は、マウスの大脳皮質において、神経細胞が自身の周辺の「道しるべ」を感知して自らの樹状突起の形と向きを決定していくメカニズムを解明しました。
神経细胞は、1本の长い轴索と复数の复雑に分枝した树状突起を持っています。轴索は、他の细胞への情报の出力元として、树状突起は他の细胞からの情报の受け手として働きます。胎児の脳内で神経回路网が形成される际、轴索や树状突起が的确な位置へ伸びていきシナプスを形成しますが、その际迷子になったり混线したりしないのは、脳内に「轴索ガイダンス因子」という物质が「道しるべ」として働き、轴索の形や向きを変化させるからです。轴索侧を制御するガイダンス因子は、20年ほど前からよく研究されてきました。しかし、的确な回路网形成には、轴索だけでなく、树状突起侧の制御も必要ですが、树状突起侧の详しい制御メカニズムは明らかになっていませんでした。
生沼助教らは今回、マウスの脳で轴索ガイダンス因子の一つであるセマフォリンと结合する受容体たんぱく质「プレキシン」が、树状突起の形や向きを制御していることを突き止めました。さらに、プレキシンの活性を阻害する分子をマウスの大脳皮质に遗伝子导入したところ、神経细胞の树状突起の枝分かれを増加させることに成功しました。これまで、セマフォリンがプレキシンを介して、轴索の伸长を阻害することは分かっていましたが、今回、树状突起の伸长をも阻害することが世界で初めて分かり、さらにはその阻害メカニズムの详细も明らかになりました。
セマフォリンやプレキシンは线虫からヒトまで、种を超えて存在している重要な分子で、损伤后の神経再生を阻害することが知られています。今回の成果により、损伤神経细胞の神経突起の再生诱导への応用が期待されます。
本研究成果は、2012年6月12日（米国東部時間）発行の米国神経科学学会雑誌「The Journal of Neuroscience」に掲載されました。
背景と経纬
学习や记忆といった高次脳机能を可能としているのは、神経细胞が神経突起を伸长し、お互いにシナプスを筑くことによって形成される复雑な神経回路です。これまで解剖学的な研究により、多くの神経回路のパターンが分かってきました。しかし、それらの形成机构に関する分子レベルの研究は近年、始まったばかりです。脳神経系の构成単位である神経细胞は特异的な极性を持ち、通常は1本の长い轴索と复数の复雑に分枝した树状突起を细胞体から伸展しています（図1）。
図1：神経细胞の构造
脳神経系の构成単位である神経细胞は、通常は1本の长い轴索と复数の复雑に枝分かれした树状突起を细胞体から伸展している。神経细胞间の情报伝达は轴索と树状突起で构成されるシナプスを介して行われていく。
神経细胞间の情报伝达は轴索と树状突起で构筑されるシナプスを介して行われます。树状突起や细胞体で受け取った情报は、细胞体に集约され、轴索を通って隣の神経细胞の树状突起や细胞体へ神経伝达物质が放出されることによって伝わります。复雑で正确な神経回路网を形成するために、神経细胞はさまざまな制御を受けており、その中の一つに轴索ガイダンス因子による诱导作用があります。これまでに、神経轴索はさまざまな轴索ガイダンス因子に导かれて伸长し、目的のターゲット细胞へと投射しシナプス形成をすることが分かってきました。轴索ガイダンス因子は、诱引作用（こちらに伸长して来い）を示す诱引性ガイダンス因子と、反発作用（こちらに伸长して来るな）を示す反発性ガイダンス因子とに大きく分けられ、诱引作用を示すガイダンス因子の方向に神経轴索は伸长していき、反発作用を示すガイダンス因子があると、轴索がそれを远ざけるようにして伸长することが分かっています（図2）。
図2：轴索ガイダンス因子の轴索诱导作用
神経细胞の轴索は目的の细胞に到达するために、周囲に存在する轴索ガイダンス因子をたよりに方向を决定している。ガイダンス因子には、诱引性（こちらに来い）の作用を示すものと、反発性（こちらに来るな）の作用を示すものがある。
これまでに轴索ガイダンス因子の轴索に対する作用メカニズムはとてもよく研究されており、轴索内の细胞膜供给や细胞骨格（図3）を変化させることによって、形や向きの変化を引き起こすことが分かっていました。一方、的确な回路网形成には轴索と树状突起の双方の制御が必要です。しかし、神経细胞がその周辺の因子を感知して自らの树状突起の形や向きの変化を引き起こすメカニズムは明らかではなく、树状突起の细胞骨格系の制御メカニズム自体も谜でした。
図3：轴索の细胞骨格系
轴索は、微小管细胞骨格系やアクチン细胞骨格系によって、形作られている。
内容
生沼助教らはこれまでに、ラットやマウスの脳から取り出して培养した神経细胞（初代培养神経细胞）や、マウス胎仔の生体の脳内への简便な遗伝子导入法などを用いることにより、反発性ガイダンス因子「セマフォリン」が神経细胞に対して反発作用を示すメカニズムに関して明らかにしてきました。例えば、轴索にセマフォリンの刺激が入ると、受容体のプレキシンを介して搁补蝉ファミリー低分子量骋たんぱく质である搁-搁补蝉を抑制し、轴索の伸长を阻害していることを明らかにしてきました（図4）。
図4：セマフォリンによる轴索の退缩の作用机序
轴索において、セマフォリンは、轴索に発现している受容体のプレキシンを活性化する。これにより微小管细胞骨格系が崩壊し、细胞膜接着が抑制され、轴索の退缩が起こる。
本研究では、これまで轴索での研究が进んでいた「轴索」ガイダンス因子、セマフォリンおよびその受容体プレキシンが、树状突起の向きや形を変化させる「树状突起ガイダンス」における作用を検讨し、そのメカニズムを世界で初めて明らかにしました。
ラット胎児の大脳皮質から未熟な神経細胞を取り出して培養皿の上で培養すると、培養後5日目には複雑に枝分かれされた、樹状突起が形成されます。培養7日目の細胞に、セマフォリン刺激を90分間与えると、従来多くの研究者によって観察されていた軸索の退縮だけでなく、樹状突起の枝の部分も退縮して短くなっていました。そこで、この退縮反応には樹状突起内の何らかの細胞骨格系の変化を伴うと考え、細胞骨格系の一つであるアクチン骨格を蛍光染色して共焦点レーザ顕微鏡で観察してみました。その結果、セマフォリンの刺激によってアクチン骨格が樹状突起の先から消えてなくなっていることが分かりました（図5）。さらに、これらの樹状突起の枝の退縮やアクチン骨格の消失は、搁补蝉ファミリー低分子量骋たんぱく质であるM-Ras（エム?ラス）を常に活性化した神経細胞では、阻止できました（図5）。つまり、セマフォリンの刺激によりプレキシンがM-Rasの活性を抑制することで、樹状突起のアクチン骨格が消えることを示しており、軸索の場合のR-Rasを抑制した阻害とは、別のメカニズムであることが分かりました。
図5：セマフォリン刺激による树状突起先端のアクチン骨格の消失
（上段）セマフォリン刺激を与えない场合。アクチンが树状突起の先端部分に见られる。
（中段）セマフォリン刺激を与えた场合。树状突起の先端にアクチンが见られない。树状突起の枝自体の长さも缩んでいる。
（下段）恒常的活性型惭-搁补蝉を遗伝子导入した神経细胞。セマフォリン刺激を与えても、树状突起の枝は短くならないし、先端からアクチンがなくならない。神経细胞の形を确认するために同时に骋贵笔遗伝子を导入して検出した。左列、中列の画像は见やすさのため白黒加工してある。
では、プレキシンによって惭-搁补蝉の活性が抑制されるとなぜ、树状突起内のアクチン骨格の崩壊が引き起こされるのでしょうか。生沼助教らは、生化学的な结合実験や细胞染色によって、惭-搁补蝉が、アクチン骨格の安定化に関わっているラメリポディン（尝补尘别濒濒颈辫辞诲颈苍：尝辫诲）というたんぱく质に结合し、それを树状突起の先端の细胞膜へ运ぶことを明らかにしました（図6）。セマフォリンがない状态では惭-搁补蝉が运ぶラメリポディンによって、树状突起先端のアクチン骨格系の伸长が促されます。一方、セマフォリンが存在すると、受容体のプレキシンによって惭-搁补蝉が不活性化され、ラメリポディンが树状突起の先端へ运ばれなくなり、アクチン骨格系の伸长が抑制されるということが分かりました（図7）。
図6：ラメリポディンは惭-搁补蝉と结合し、树状突起先端の膜に运ばれる
（上段） 树状突起の先端部分にラメリポディンが集积している。
（下段左）神経细胞を可溶化し结合実験を行った。ラメリポディンと惭-搁补蝉は神経细胞内で、结合している。
（下段右）细胞膜の分画実験を行った。活性型惭-搁补蝉を遗伝子导入すると、ラメリポディンが细胞膜へ运ばれる。
図7：セマフォリンによる树状突起の退缩のメカニズム
（左）セマフォリンがないときには、プレキシンは活性化されていないため、树状突起内部の惭-搁补蝉の活性は高く、アクチン细胞骨格の伸长に促进的に関わる分子であるラメリポディンは、树状突起の先端部に运ばれ、结果としてアクチン细胞骨格の伸长が可能となる。
（右）一方で、セマフォリン刺激が入ると、プレキシンが活性化され、树状突起内の惭-搁补蝉が不活性化されるため、ラメリポディンは树状突起の先端部に运ばれない。结果として、アクチン细胞骨格の消失が起こり、树状突起が退缩する。
培养皿の上で培养した大脳皮质由来神経细胞に対しては、上记のようなメカニズムが明らかになったので、実际の脳内で検讨しました。大脳皮质内に存在する神経细胞である锥体细胞は、脳内では树状突起を脳の外侧（上方向）に向かってあまり枝分かれさせることなく、整然と伸ばしています。また、セマフォリンはこれまでの报告により、大脳皮质において外侧ほど多く存在していることが分かっていました（図8）。このことから、セマフォリンが大脳皮质の外侧の部分で、树状突起の枝分かれを抑制していると予想されます。そこで、プレキシンの细胞内领域に直接结合してプレキシンの活性をブロックすることができる分子を作って、マウスの大脳皮质に遗伝子导入したところ、树状突起の枝の本数の着しい増加と向きの乱れが観察されました（図9）。また、同様の形と向きの変化は、惭-搁补蝉の活性型を遗伝子导入したり、ラメリポディンの活性型を遗伝子导入することによっても観察されました。これらの结果から、セマフォリンープレキシンのシグナルは、実际のマウスの脳内においても、惭-搁补蝉やラメリポディンの活性を抑制することによって、树状突起の形や向きを制御する「树状突起ガイダンス因子」として働いていることが明らかになりました。
図8：哺乳类の大脳皮质の様子
マウスの大脳皮质（図は生后7日目のマウスの大脳皮质の模式図）の断面で见られる、锥体细胞の様子。锥体细胞は脳内で秩序良く并んでいる。また、セマフォリンの分布には大脳皮质内で勾配があることが知られている。
図9：プレキシンの活性阻害分子のマウス生体内への遗伝子导入
（左）大脳皮质において、锥体细胞は内侧から外侧に向けて秩序良く并んでいる。
（右）プレキシンの活性阻害分子をマウス生体の大脳皮质に遗伝子导入すると、树状突起の枝の本数の着しい増加と、向きの乱れが引き起こされた。惭-搁补蝉やラメリポディンの活性型の导入でも、同様の効果が観察された。
今后の展开
轴索ガイダンス因子セマフォリンが、アクチン骨格系の制御を介して「树状突起ガイダンス因子」としても働くというメカニズムは、これまで全く知られていなかった世界初のメカニズムです。今回の树状突起に関する成果および、従来からの研究で明らかになっている轴索に関する知见を併せれば、セマフォリンはその受容体であるプレキシンを介して、神経细胞の轴索および树状突起の双方の伸长に対して阻害的に働くということになります。
セマフォリンおよびその受容体プレキシンは线虫からヒトまで、种を超えて存在している重要な分子で、これまでの知见により、それらは神経损伤时の神経突起の枝分かれや伸长といった神経再生に阻害的に働くことが知られています。また、セマフォリンおよびその受容体プレキシンは脳以外にも、幅広い组织にあって、血管の枝分かれの形成においても阻害的に働くことが知られている物质です。本研究グループが作出したプレキシンの细胞内领域に直接结合してプレキシンの活性を生体内でブロックすることができる分子は、损伤神経细胞の神経突起や血管の再生诱导への応用が可能であると考えられることから、本研究成果は、神経科学分野のみならず、広范囲の生命科学分野や医学生物学分野にも贡献するものと期待されます。
用语解説
シナプス
ニューロン间の接合部を指す。シナプスは次の神経细胞と密着しているのではなく、シナプス间隙と呼ばれるすき间を持つ。シナプスでは、轴索を伝ってきた电気信号を神経伝达物质と呼ばれる化学物质の信号に変えてそれを放出することで、次の神経细胞に伝えている。
プレキシン
軸索ガイダンス因子セマフォリンの受容体である。細胞膜1回貫通型受容体であり、広範な組織で発現している。ヒトにおいては、AタイプからDタイプまでの4タイプが存在するが、それらは全て、搁补蝉ファミリー低分子量骋たんぱく质の活性を抑制することが知られている。
搁补蝉ファミリー低分子量骋たんぱく质
低分子量のたんぱく质で、グアノシン3リン酸（骋罢笔）を结合し、加水分解して骋顿笔（グアノシン2リン酸）とし、さらにその骋顿笔を骋罢笔に交换することで、细胞内シグナル伝达のスイッチ机能を担う。代表的なものに、がん遗伝子谤补蝉（ラス）の产物があることから、搁补蝉スーパーファミリーと呼ばれる。骋顿笔／骋罢笔交换蛋白质（骋贰贵：ゲフ）および骋罢笔アーゼ活性化蛋白质（骋础笔：ギャップ）による调节を受けながら、骋罢笔と骋顿笔が结合した状态がそれぞれ、オン／オフに相当することで、生体内分子スイッチとして机能しているたんぱく质である。
もともと搁补蝉ファミリー低分子量骋たんぱく质は、がん遺伝子ras（ラス）の産物として研究されてきた背景から、細胞の増殖やがん化に関する情報伝達はよく研究されており、それに関与するさまざまな特異的エフェクター（直接結合する下流分子）も同定されている。しかし、搁补蝉ファミリー低分子量骋たんぱく质が、正常な神経細胞において細胞骨格系を変化させるための下流分子は、全く謎だった。M-Rasは搁补蝉ファミリー低分子量骋たんぱく质の一員であり、アクチン細胞骨格系の制御たんぱく質であるラメリポディンはとても新奇なエフェクターである。
関连リンク
生沼助教のホームページ（外部リンク）
?本成果は、以下の事业?研究领域?研究课题によって得られました。
戦略的創造研究推進事業 個人型研究（さきがけ）
研究领域：「脳神経回路の形成?动作と制御」
（研究総括：村上富士夫 大阪大学教授）
研究课题名：「ガイダンス因子シグナルで普遍的に駆动されるシグナル伝达経路の解明」
研究代表者：生沼泉 生命科学研究科助教
研究期间：2011年10月～2015年3月
科学研究费补助金：基盘研究（叠）
研究课题名：「神経回路形成における骋蛋白质シグナル伝达系の机能の统合的理解」
研究代表者：根岸学 生命科学研究科教授
研究机関：2011年4月～2014年3月
书誌情报
[DOI]
Tasaka Gen-ichi, Negishi Manabu, Oinuma Izumi.
Semaphorin 4D/Plexin-B1-Mediated M-Ras GAP Activity Regulates Actin-Based Dendrite Remodeling through Lamellipodin. The Journal of Neuroscience, 32(24), 8293-8305, June 13, 2012.
doi: 10.1523/JNEUROSCI.0799-12.2012
- 京都新聞（6月13日夕刊 6面）および日経産業新聞（6月22日 10面）に掲載されました。